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毛细管电泳(CE)
简介 毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)又称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE),是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。 毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容,它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平,并使单细胞分析,乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。 基础理论 1 双电层 双电...   详细内容>>

简介



毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)又称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE),是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。
毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容,它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平,并使单细胞分析,乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。

基础理论



1 双电层
双电层是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的与表面异号的离子层,凡是浸没在液体中的界面都会产生双电层。在毛细管电泳中,无论是带电粒子的表面还是毛细管管壁的表面都有双电层。
2 Zeta 电势
电介质溶液中,任何带电粒子都可被看成是一个双电层系统的一部分,离子自身的电荷被异号的带电离子中和,这些异号离子中有一些被不可逆的吸附到离子上,而另一些则游离在附近,并扩散到电介质中进行离子交换?!肮潭ā崩胱佑幸桓銮衅矫?,它和离得最近的离子之间的电势则被称之为离子的Zeta 电势。
石英材质的毛细管是毛细管电泳中最常使用的毛细管,管子内表面在pH>3 情况下带负电,当其与溶液接触时,会形成紧贴内表面的和游离的两部分离子。这两部分离子组成的与表面电荷异号的离子层,即为双电层,其中第一部分又称之为Stern 层。第二层为扩散层。扩散层中游离部分离子的电荷密度随着和表面距离的增大而急剧减小。在Stern 层和双电层的游离部分的起点的边界层之间的电势称之为管壁的Zeta 电势。典型值大体在0-100 mV 之间,Zeta 电势的值随距离增大按指数衰减,使其衰减一个指数单位所需的距离称之为双电层的厚度(δ)。熔硅表面的Zeta 电势与它表面上的电荷数及双电层厚度有关,而这些又受到离子的性质、缓冲溶液pH 值、缓冲溶液中阳离子和熔硅表面间的平衡等因素的影响。
3 淌度、绝对淌度和有效淌度
带电粒子在直流电场作用下于一定介质(溶剂)中所发生的定向运动称为电泳。单位电场下的电泳速度称为淌度。在无限稀释溶液中(稀溶液数据外推)测得的淌度称为绝对淌度。
电场中带电离子运动除了受到电场力的作用外,还会受到溶剂阻力的作用。一定时间后,两种力的作用就会达到平衡,此时离子作匀速运动,电泳进入稳态。实际溶液的活度不同,特别是酸碱度的不同,所以样品分子的离解度不同,电荷也将发生变化,这时的淌度可称为有效电泳淌度。一般来说,离子所带电荷越多、离解度越大、体积越小, 电泳速度就越快。
4 电渗、电渗流和表观淌度
电渗是推动样品迁移的另一种重要动力。所谓电渗是指毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发生的定向流动。电渗是由定域电荷引起。定域电荷是指牢固结合在管壁上、在电场作用下不能迁移的离子或带电基团。在定域电荷对溶液中的反号离子吸引下形成了所谓的双电层,致使溶剂在电场作用(以及碰撞作用)下整体定向移动而形成电渗流(毛细管中的电渗流为平头塞状)。
毛细管区带电泳条件下,电渗流从阳极流向阴极。电渗流大小受到Zeta电势、双电层厚度和介质粘度的影响,一般说来,Zeta 电势越大,双电层越薄,粘度越小,电渗流值越大。
在毛细管电泳中,样品分子的迁移是有效电泳淌度和电渗流淌度的综合表现,这时的淌度称为表观淌度。在多数的水溶液中,石英(或玻璃)毛细管表面因硅羟基解离会产生负的定域电荷,产生指向负极的电渗流。在毛细管中电渗速度可比电泳速度大一个数量级,所以能实现样品组分同向泳动。正离子的运动方向和电渗一致,因此它应最先流出。中性分子与电渗流同速,随电渗而行。负离子因其运动方向和电渗相反,在中性粒子之后流出。电渗流与pH 的关系十分密切。电渗受Zeta 电势的影响,Zeta 电势由毛细管壁表面的电荷决定,而电荷又受到缓冲溶液的pH 值影响,所以电渗流的值是缓冲溶液的pH 值的函数,一般随pH 值的增大而增大,到中性或碱性时,其值会变得很大。此外,任何影响管壁上解离的因素,如毛细管洗涤过程、电泳缓冲液组成、粘度、温度等都会影响或改变电渗流。电磁场以及许多能与毛细管表面作用的物质如表面活性剂、蛋白质等,都可以对电渗流产生很大影响。
电渗在电泳分离中扮演着重要角色,是伴随电泳产生的一种电动现象。多数情况下,电渗流速度是电泳速度的5-7 倍。因此,在毛细管电泳(CE)中利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移,在一次CE 操作中同时完成正、负离子的分离测定。由于电渗流的大小和方向可以影响CE 分离的效率、选择性和分离度,所以成为优化分离条件的重要参数。电渗流的细小变化将严重影响CE 分离的重现性(迁移时间和峰面积)。所以,电渗流的控制是CE 中的一项重要任务。用来控制电渗流的方法主要有改变缓冲溶液的成分和浓度;改变缓冲溶液的pH 值;加入添加剂;毛细管内壁改性-物理或化学方法涂层及动态去活;外加径向电??;改变温度等。
中性物质可以用作测定电渗的标记物。例如二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、β-萘酚、丙酮、甲醇和乙醇等,均可作为电渗标记物。

分类



1. 分离模式
毛细管电泳根据分离模式不同可以归结出多种不同类型的毛细管电泳,毛细管电泳的多种分离模式,给样品分离提供了不同的选择机会,这对复杂样品的分离分析是非常重要的。
单根毛细管、单根填充管CGE、阵列毛细管电泳、芯片式毛细管电泳、毛细管电泳/质谱、毛细管电泳/核磁共振、毛细管电泳/激光诱导荧光、
2. 操作方式
毛细管电泳可以按操作方式重新分为手动、半自动及全自动型毛细管电泳。
3. 分离通道形状
按分离通道形状分为圆形、扁形、方形毛细管电泳等。
4. 缓冲液的介质
根据配制缓冲液的介质的不同,可以把CE分为水相毛细管电泳和非水毛细管电泳(NACE)。NACE是以有机溶剂作介质的电泳缓冲液代替以水为介质的缓冲溶液,增加了疏水性物质的溶解度,特别适用于在水溶液中难溶而不能用CE分离的物质或在水溶液中性质相似难以分离的同系物,拓宽了CE的分析领域。

特点



毛细管电泳通常使用内径为25-100 μm 的弹性(聚酰亚胺)涂层熔融石英管。标准毛细管的外径为375 μm,有些管的外径为160 μm。毛细管的特点是:容积?。ㄒ桓?00 cm×75 μm 管子的容积仅4.4 μL);侧面/截面积比大,因而散热快、可承受高电?。?00-1000 V/cm);可使用自由溶液、凝胶等为支持介质;在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。
由此,可使毛细管电泳具备如下优点:
(1) 高效 塔板数目在105-106 片/m 间,当采用CGE 时,塔板数目可达107 片/m 以上;
(2) 快速 一般在十几分钟内完成分离;
(3) 微量 进样所需的样品体积为nL 级;
(4) 多模式 可根据需要选用不同的分离模式且仅需一台仪器;
(5) 经济 实验消耗不过几毫升缓冲溶液,维持费用很低;
(6) 自动 CE 是目前自动化程度较高的分离方法。
毛细管电泳的缺点是:
(1) 由于进样量少,因而制备能力差;
(2) 由于毛细管直径小,使光路太短,用一些检测方法(如紫外吸收光谱法)时,灵敏度较低;
(3) 电渗会因样品组成而变化,进而影响分离重现性。

仪器系统



毛细管电泳系统的基本结构包括进样系统、两个缓冲液槽、高压电源、检测器、控制系统和数据处理系统。
由于毛细管内径的限制,检测信号是CE系统最突出的问题。紫外可见法(UV)是CE常用的检测方法,但是受到仪器、单波长等因素的限制。目前应用最广泛的是二极管阵列(PDA)检测器。常规的检测器还有灵敏度很高的激光光热(LIP)和荧光(FL)检测器。近些年,在实际应用中还产生了激光诱导荧光(LIF)、有良好选择性的安培(EC)、通用性很好的电导(CD)助以及可以获得结构信息的质谱(MS)等多种检测器。迄今为止,除了电感耦合等离子体(ICP)和红外(IR)技术没有和CE联用,其他的检测方法均和CE联用并且大部分实现商品化。使用CE时应该根据所分析物质的特点,选择相应分离模式和检测器,以扬长避短,得到最佳分析效果。

影响分离因素



1 缓冲液
缓冲试剂的选择主要由所需的pH决定,在相同的pH下,不同缓冲试剂的分离效果不尽相同,有的可能相差甚远。CE中常用的缓冲试剂有:磷酸盐、硼砂或硼酸、醋酸盐等。
缓冲盐的浓度直接影响到电泳介质的离子强度,从而影响Zeta电势,而Zeta电势的变化又会影响到电渗流?;撼逡号ǘ壬?,离子强度增加,双电层厚度减小,Zeta电势降低,电渗流减小,样品在毛细管中停留时间变长,有利于迁移时间短的组分的分离,分析效率提高。同时,随着电解液浓度的提高,电解液的电导将大大高于样品溶液的电导而使样品在毛细管柱上产生堆积的效果,增强样品的富集现象,增加样品的容量,从而提高分析灵敏度。但是,电解液浓度太高,电流增大,由于热效应而使样品组分蜂形扩展,分离效果反而变差。此外,离子还可以通过与管壁作用以及影响溶液的粘度、介电常数等来影响电渗,离子强度过高或过低都对提高分离效率不利。
2 pH值
缓冲体系pH的选择依样品的性质和分离效率而定,是决定分离成败的一大关键。不同样品需要不同的pH分离条件,控制缓冲体系的pH值,一般只能改变电渗流的大小。pH能影响样品的解离能力,样品在极性强的介质中离解度增大,电泳速度也随之增大,从而影响分离选择性和分离灵敏度。pH还会影响毛细管内壁硅醇基的质子化程度和溶质的化学稳定性,pH在4-10之间,硅醇基的解离度随pH的升高而升高,电渗流也随之升高。因此,pH为分离条件优化时不可忽视的因素。
3 分离电压
在CE中,分离电压也是控制电渗的一个重要参数。高电压是实现CE快速、高效的前提,电压升高,样品的迁移加大,分析时间缩短,但毛细管中焦耳热增大,基线稳定性降低,灵敏度降低;分离电压越低,分离效果越好,分析时间延长,峰形变宽,导致分离效率降低。因此,相对较高的分离电压会提高分离度和缩短分析时间,但电压过高又会使谱带变宽而降低分离效率。电解质浓度相同时,非水介质中的电流值和焦耳热均比水相介质中小得多,因而在非水介质中允许使用更高的分离电压。
4 温度
温度影响分离重现性和分离效率,控制温度可以调控电渗流的大小。温度升高,缓冲液粘度降低,管壁硅轻基解离能力增强,电渗速度变大,分析时间减短,分析效率提高。但温度过高,会引起毛细管柱内径向温差增大,焦耳热效应增强,柱效降低,分离效率也会降低。
5 添加剂
在电解质溶液中加入添加剂,例如中性盐、两性离子、表面活性剂以及有机溶剂等,会引起电渗流的显著变化。表面活性剂常用作电渗流的改性剂,通过改变浓度来控制电渗流的大小和方向,但当表面活性剂的浓度高于临界胶束浓度时,将形成胶束。加入有机溶剂会降低离子强度,Zeta电势增大,溶液粘度降低,改变管壁内表面电荷分布,使电渗流降低。在电泳分析中,缓冲液一般用水配制,但用水一有机混合溶剂常常能有效改善分离度或分离选择性。
6 进样
CE的常规进样方式有两种:流体力学和电迁移进样。电迁移进样是在电场作用下,依靠样品离子的电迁移和(或)电渗流将样品注入,故会产生电歧视现象,会降低分析的准确性和可靠性,但此法尤其适用于粘度大的缓冲液和CGE情况。流体力学进样是普适方法,可以通过虹吸、在进样端加压或检测器端抽空等方法来实现,但选择性差,样品及其背景同时被引入毛细管,对后续分离可能产生影响。通过进样时间也可以来改善分离效果,进样时间过短,峰面积太小,分析误差大。进样时间过大,样品超载,进样区带扩散,会引起峰之间的重叠,与提高分离电压一样,分离效果变差。
另外,毛细管电泳技术的高分离性能以及消耗试剂少等特点使其分析领域得到了广泛的应用,但是其常规分析的灵敏度不能适应痕量分析的要求,限制了它的应用和推广。样品前处理技术可以提高样品通量或将痕量分析物进行预富集,去除样品基质,将其与毛细管电泳技术联用不仅可以提高分析的灵敏度,同时也消除了大部分可能的基质干扰,是一种比较理想的富集分离检测技术。常用的有CE一流动注射联用技术、固相萃取-CE联用技术、固相微萃取-CE联用技术、液相微萃取-CE联用技术、微透析-CE联用技术和膜萃取-CE联用技术。

应用



CE具有多种分离模式(多种分离介质和原理),故具有多种功能,因此其应用十分广泛,通常能配成溶液或悬浮溶液的样品(除挥发性和不溶物外)均能用CE进行分离和分析,小到无机离子,大到生物大分子和超分子,甚至整个细胞都可进行分离检测。它广泛应用于生命科学、医药科学、临床医学、分子生物学、法庭与侦破鉴定、化学、环境、海关、农学、生产过程监控、产品质检以及单细胞和单分子分析等领域。
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